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TEST RISOLUZIONE SU DIATOMEE

 obbiettivi e mezzi di montaggio a confronto

 

Personalmente considero le diatomee (dette anche Bacillarioficee) quanto di meglio il mondo microscopico abbia da offrirci.

Molte delle caratteristiche di queste alghe, ci vengono rivelate solo mediante utilizzo di sistemi ottici capaci di alte aperture numeriche (vedi nota alla fine), e di elevati ingrandimenti nonché di un’ ottima correzione (cromatica in primis);

non a caso,  le diatomee vengono utilizzate come test per verificare la bontà ottica degli obbiettivi;

Chi mastica un po’ di microscopia, avrà sicuramente appreso che esistono vari tipi di obbiettivi: acromatici, fluorite (o semi apo), apo, semi planari planari etc.

A mio avviso, per  l’osservazione delle minuscole strutture delle diatomee, il parametro che più  interessa è quello della correzione cromatica;

questa indirettamente è legata alla risoluzione..più un obbiettivo è corretto, migliore sarà il risultato finale…ecco perché:

 

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RESOLUTION TEST ON DIATOMS 

 objectives and mountant medium comparison 

 

The diatoms (said also Bacillarioficee) are perhaps best subject in the microscopic world. 

A lot of the characteristics of these algas, are revealed only  through use of optic systems whit maximum  numerical aperture ( see note ), and high magnifications as well as good correction (chromatic in first);

The diatoms  are often  used as test in order to verify the optical goodness of the objectives; 

Who know someting in microscopy science,   it know that there are many kind of objectives: achromatic, fluorite (or semi – apo), apo, semi-plan plan etc. 

To observe  the smaller structures of the diatoms, the parameter that more it interests  is  chromatic correction;  

indirectly this is tied up to the resolution.. more cromatically correct is an objective,  best it will be the final result …here because:

 

I limiti degli obbiettivi

 

Prendiamo in considerazione due obbiettivi :

apocromatico 100x 1,30 A.N.

acromatico     100x 1,30 A.N.

Essi, nonostante una differenza di prezzo fuori da ogni logica, sembrano avere le stesse caratteristiche per quanto riguarda il potere risolutivo (vedi nota sotto) , e questo potrebbe anche essere vero.

Ma se si osserva per un attimo la formula del potere risolutivo (fig.1),

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Limits of objectives

 

Consider now two objectives: 

apochromatic 100x 1,30 A.N. 

achromatic     100x 1,30 A.N. 

they seem to have the same characteristics for the resolution power, and this could be also true. 

But if you observe for an instant the resolution power formula (fig.1),

 

 

 

 

λ                              λ

———-   ≥   d   ≥    ———–

n  sin u                    2n  sin u

             λ=                 lunghezza d’onda della luce (546 nm)

d=                   potere risolutivo dell’obbiettivo

      n sin u =                            apertura numerica dell’obbiettivo

                   Fig.1:  Formula del potere risolutivo

                                Resolution power formula

si intuisce che il potere risolutivo è direttamente proporzionale ad A.N.(vedi note in basso) e inversamente proporzionale alla lunghezza d’onda della luce (λ)!

you realize that resolution power is directly proportional to A.N. and inversely proportional to the wavelength of the light (λ)!

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Il filtro blu

Per diminuire λ , il metodo più semplice è quello collocare nel portafiltri del condensatore o sull’illuminatore, un filtro blu molto denso (fig.2).

In questo modo si ottiene una straordinaria risoluzione dell’immagine che mostra particolari prima invisibili (fig.3).

ATTENZIONE: questa regola vale, però, solo per obbiettivi corretti per tali lunghezze d’onda, quindi apocromatici e fluorite!

Se si prova infatti ad utilizzare un filtro blu con un acromatico, i risultati saranno disastrosi;

questi ultimi vanno bene  con filtri di colore verde aumentando anche il contrasto generale dell’immagine.

In definitiva, ecco svelato il perché i due obbiettivi del nostro esempio, pur avendo medesime caratteristiche di ingrandimento e  A.N., nascondono differenze nella capacità risolutiva!

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A blue filter

To decrease λ ,  simplest method is  to put in the filter holder  or on the illuminator, a very dense blue filter (fig.2). 

 this way you have extraordinary resolution of the image that shows particulars invisible before (fig3). 

ATTENTION: this is true only for objective correct for blue wave lenght, like apochromatic and fluorite lens! 

If you use a blue filter in combination whit an achromatic one, the results  will be disastrous; 

achromatics work very good with green  filters, increasing the general contrast of the image. 

In conclusion, here because two objectives of our example, also having same characteristics of magnification and A.N., they hide differences in the resolution power! 

 

 

Fig.2: Filtro blu 

Blue filter

  

Fig. 3

Frustulia romboides ripresa senza filtro blu in alto e con filtro blu in basso

Frustulia romboides whitout blue filter upper image, and whit this filter (under image) 

IL CONDENSATORE

Tutto  ciò è abbastanza, se si parla di obbiettivi con A.N. inferiore ad 1.0; se utilizziamo un obbiettivo ad immersione

è chiaro che la sua straordinaria apertura, per offrirci il massimo potere risolutivo, deve essere accompagnata da un’ apertura altrettanto generosa del condensatore;

sarebbe un delitto, infatti utilizzare un planapo  magari da 60x con A.N. 1,40 con un condensatore da A.N. 0,90, perché i dettagli più fini non sarebbero visibili…

un condensatore, invece, con la medesima apertura dell’obbiettivo, o poco meno e con la lente superiore immersa anche  in olio (immersione omogenea) darà un cono di luce maggiore che porterà con se un maggior numero di dettagli!

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 THE CONDENSER

 

 

All  this is ok if you use  objectives with A.N. lower than  1.0; if we use an immersion objective, because its extraordinary A.N. you need an oil immersion condenser whit biggest numerique aperture. 

 it would be a crime, to use  a planapo  60x with A.N. 1,40 in combination with a condenser from A.N. 0,90, because the finest details would not be visible… 

a condenser, instead, with the same opening of the objective whit top lens oiled too (homogeneous immersion) will give a cone of  light greater, that brings with it a greater  number of detail!

 

 

 

Ecco alcune immagini del  confronto di obbiettivi con diversa correzione:

Here some picture of the comparison of objectives with different    correction:

 

Obbiettivo cinese acromatico 10x

Chinese achromatic objective 10x 

 

Lomo apo 10x

Lomo apo 10x

 

Zeiss Neofluar 16x ph2

Zeiss Jena Aphocromat 16x

Zeiss Neofluar 25x

Zeiss planapo 25x

Navicula lira

Obbiettivo acromatico cinese 40x

Zeiss Neofluar 40x ph2

Lomo apo 40x

Zeiss plan apo 40x/1.0 oil

I mezzi di montaggio

Mountant

Oltre alle ottiche del microscopio, bisogna tenere conto anche del mezzo di montaggio in cui si trova immerso il campione da osservare; esso influisce molto sul contrasto dell’immagine e quindi sulla sua qualità generale.

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Another thing you need to get  good result, is a good  medium between glass and coverglass from which depend contrast and final quality of image.

 

L’indice di rifrazione

“Indicato con “n” esso rappresenta il fattore numerico che indica di quanto una radiazione (la luce nel nostro caso) viene rallentata rispetto alla velocità nel vuoto, quando questa attraversa un materiale”.

Consideriamo ora vari mezzi di montaggio e il relativo indice di rifrazione, come ad esempio: acqua n= 1,33; balsamo del canada n= 1,51; Zrax n=1,70 (ca); L’aria benchè non sia un liquido, consideriamola comunque un mezzo di montaggio la sua n= 1,0.

Osserviamo  la foto in basso (fig 1):

 

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The refractive index (or index of refraction) of a medium is a measure of how much the speed of light (or other waves such as sound waves) is reduced inside the medium. 

We now consider various means of mountants and the relative index of refraction, as for instance: water n = 1,33;  canada balsam n = 1,51; Zrax n=1,70 (ca); In the air  “n” = 1,0 . 

 now observe the photo  below (fig.1): 

 

Fig.1   descrizione nel testo

 

Notare come la bacchetta di vetro appare diversamente se immersa in diversi mezzi (rispettivamente da sin. Acqua , balsamo del canada, Zrax) e come nel flaconcino centrale sembra quasi sparire proprio perché il balsamo ha un “n” vicinissimo a quello del vetro.

 

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Look like glass bar in central bottle (respectively from left. Water, Canada balsam, Zrax)  seems to disappear really because the Canada balsam has  “n” near to that of the glass. 

 

 

 

 

 

 

 

Nota

Note

-Potere risolutivo di un obbiettivo: è la capacità di distinguere separatamente due punti molto vicini tra di loro.

 

  Resolving power is the ability of the objectives to measure the angular separation of the points in an object.

 

-A.N.: (Apertura numerica) è una misura espressa in gradi del semiangolo, del più ampio cono di luce, con vertice sull’oggetto, che entra nell’obiettivo e contribuisce a formare l’immagine.

 

Numerical aperture (NA) of an optical system is a dimensionless number that characterizes the range of angles over which the system can accept or emit light. The exact definition of the term varies slightly between different areas of optics.

 

 

 

-Alcuni montanti come Zrax (creato apposta per diatomee o radiolari) ad esempio se utilizzati in contrasto di fase provocano un’ inversione del contrasto stesso: se si è equipaggiati, ad esempio, con contrasto di fase positivo il campione apparirà come se osservassimo in contrasto di fase negativo e viceversa.

 

Some mountant medium  as Zrax (created  for diatoms or radiolaria) for instance if used in Phase contrast they give an inversion of the contrast: if you are equipped, for instance, with positive Phase contrast the sample will appear as if you observe in negative Phase contrast…….. and viceversa. 

 

-Per la pulizia delle diatomee vedere qui :

To clean the diatoms please see here:

http://www.microthele.it/micro/micro.htm

-         Per acquisto di zrax o campioni di diatomee vedere qui:

-         To buy diatoms sample and Zrax see here:

http://otticaturi.it/set-ottica.htm

-         cliccando il link in basso è possibile accedere ad una miniera di informazioni circa gli obbiettivi e la microscopia in genere.

-         Clic on link below to get a lot informations in microscopy science.

http://www.funsci.com/fun3_it/sini/mo/mo.htm

 

Arturo Agostino